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FSH的“代謝魔法”：乳酸化修飾讓糖酵解“指揮”線粒體生物發(fā)生
發(fā)布時間： 2026-03-06 點擊次數(shù)： 27次
n 研究背景
卵泡刺激素（FSH）是驅(qū)動卵泡發(fā)育的關鍵內(nèi)分泌信號，雖已知其能促進顆粒細胞（GCs）的糖酵解和乳酸生成，但糖酵解通量如何與線粒體生物發(fā)生相偶聯(lián)的機制尚不清楚。近年來，乳酸被重新認識為一種生物活性代謝物，可通過組蛋白乳酸化修飾將細胞代謝狀態(tài)與染色質(zhì)結(jié)構和基因調(diào)控聯(lián)系起來。然而，這種代謝-表觀遺傳調(diào)控機制是否在FSH介導的卵泡發(fā)育生理過程中發(fā)揮作用，特別是如何協(xié)調(diào)線粒體生物發(fā)生以滿足卵泡生長的能量需求，仍是未解之謎。
n 研究結(jié)果
2.1 FSH誘導的線粒體生物發(fā)生伴隨卵巢顆粒細胞中H4K5la升高
研究人員通過腹腔注射FSH評估其對小鼠卵巢顆粒細胞（mGCs）線粒體生物發(fā)生的影響。結(jié)果顯示，F(xiàn)SH刺激增加了mGCs中線粒體DNA編碼的細胞se素c氧化酶II（MT-CO2）基因和mtDNA D-loop區(qū)域的拷貝數(shù)，線粒體標志物TOM20水平升高。透射電鏡進一步顯示FSH顯著增加mGCs中線粒體數(shù)量，同時保持超微結(jié)構完整性，包括膜形態(tài)和嵴組織，線粒體體積也增加，提示FSH暴露后線粒體融合增強。FSH處理還顯著上調(diào)線粒體融合蛋白MFN1、MFN2和OPA1表達，而裂變蛋白DRP1及其Ser616磷酸化水平降低，Ser637磷酸化增加，表明線粒體裂變受抑制。FSH處理還顯著提高了mGCs中ATP水平。由于FSH在卵泡發(fā)育過程中增加糖酵解導致乳酸升高，研究人員評估了乳酸是否促進FSH介導的線粒體生物發(fā)生。FSH注射后，mGCs表現(xiàn)出顯著增加的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（GLUT1）表達和乳酸水平。免疫組織化學顯示FSH處理后卵巢組織中乳酸化顯著增加，主要定位于mGCs。質(zhì)譜分析鑒定出組蛋白H4第5位賴氨酸（H4K5）的乳酸化，免疫組織化學染色顯示H4K5la在顆粒細胞中特異性富集，而卵母細胞和膜細胞信號極弱。這些發(fā)現(xiàn)表明乳酸衍生的H4K5la可能作為FSH誘導的mGCs線粒體生物發(fā)生的表觀遺傳介質(zhì)。
2.2 抑制乳酸產(chǎn)生/H4K5la抑制FSH誘導的顆粒細胞線粒體生物發(fā)生
為確定FSH是否通過乳酸/組蛋白乳酸化途徑促進線粒體生物發(fā)生，研究人員在KGN細胞中測量了FSH處理后的細胞外酸化率（ECAR）。FSH顯著增加ECAR，表明糖酵解活性增強。為調(diào)節(jié)細胞內(nèi)組蛋白乳酸化，研究人員采用兩種互補方法：（a）使用2-脫氧-D-葡萄糖（2-DG）和草氨酸鹽藥理學抑制糖酵解通量以抑制乳酸產(chǎn)生；（b）siRNA介導的乳酸脫氫酶A（LDHA）和LDHB敲低。兩種抑制劑處理均有效降低mGCs中細胞內(nèi)乳酸水平，并顯著降低FSH刺激的mGCs和KGN細胞中的全局蛋白乳酸化和H4K5la水平。免疫熒光顯示2-DG和草氨酸鹽有效抑制FSH刺激的KGN細胞中H4K5la。組蛋白乳酸化降低顯著損害了FSH誘導的顆粒細胞線粒體生物發(fā)生，表現(xiàn)為線粒體DNA拷貝數(shù)、TOM20蛋白豐度和MitoTracker Green熒光減少。考慮到2-DG和草氨酸鹽的潛在脫靶效應，研究人員通過遺傳耗竭LDHA/B來特異性調(diào)節(jié)乳酸依賴性組蛋白乳酸化。雙重LDHA/B沉默顯著降低細胞內(nèi)乳酸生成、全局蛋白乳酸化和H4K5la。免疫熒光分析證實LDHA/B敲低后FSH刺激的H4K5la受損。相應干預抑制了FSH誘導的線粒體生物發(fā)生，表現(xiàn)為線粒體DNA拷貝數(shù)減少、TOM20表達降低和MitoTracker Green染色減弱。為評估乳酸補充是否能挽救這一表型，研究人員用乳酸鈉處理LDHA/B耗竭的KGN細胞。外源性乳酸顯著恢復了FSH刺激細胞中的H4K5la和線粒體生物發(fā)生。此外，F(xiàn)SH處理顯著增強KGN細胞的氧消耗率（OCR），而抑制乳酸產(chǎn)生減弱了這一效應，乳酸補充wan全挽救了OCR。類似地，LDHA/B敲低降低了FSH刺激的ATP產(chǎn)生，乳酸鈉可恢復。使用JC-1熒光探針實時監(jiān)測線粒體膜電位（ΔΨm）發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH處理顯著增加紅色熒光（J-聚集體，表示超極化）同時降低綠色熒光（JC-1單體，表示去極化）。重要的是，藥理學抑制乳酸產(chǎn)生顯著減弱FSH誘導的ΔΨm升高，而乳酸鈉補充wan全挽救了這一超極化效應。為確定FSH是否通過抑制線粒體自噬增強線粒體含量，研究人員評估了線粒體自噬標志物。在FSH處理的KGN細胞中，PINK1/Parkin和LC3-II表達增加，而p62表達降低，與激活的線粒體自噬通量一致。FSH處理后線粒體-溶酶體共定位也增加。這些結(jié)果共同表明FSH通過乳酸/組蛋白乳酸化途徑而非抑制線粒體自噬促進顆粒細胞線粒體生物發(fā)生。
2.3 FSH通過P300/CBP催化的H4K5la促進線粒體生物發(fā)生
為鑒定負責H4K5la的酶，研究人員使用siRNA方法在KGN細胞中沉默候選?；D(zhuǎn)移酶。P300及其同源物CBP的敲低降低了H4K5la，鑒定P300/CBP為與該乳酸化特征相關的關鍵乳酸轉(zhuǎn)移酶。研究人員接下來使用C646（特異性P300/CBP拮抗劑）抑制該復合物。如預期，C646處理有效抑制FSH處理的mGCs和KGN細胞中的全局乳酸化和H4K5la。由于P300/CBP也可通過作為寫入蛋白催化乙?；?，研究人員評估了FSH處理的KGN細胞中的乙?；?。然而未觀察到顯著變化，且C646未消除全局乙?；?，表明P300/CBP不是wei一的乙酰轉(zhuǎn)移酶或其作用在這些細胞中被補償。接下來研究人員檢查了P300/CBP抑制后的線粒體生物發(fā)生。P300/CBP抑制消除了FSH誘導的線粒體DNA含量增加和TOM20表達。MitoTracker染色證實C646阻斷FSH刺激的線粒體生物發(fā)生。與此一致，C646顯著減弱FSH刺激的OCR和線粒體膜電位。為解決C646可能產(chǎn)生超出乳酸化抑制的脫靶效應的擔憂，研究人員進行了P300和CBP的單獨沉默。類似地，酶缺失顯著降低全局和H4K5乳酸化，并相應減少KGN細胞中FSH誘導的線粒體生物發(fā)生，表現(xiàn)為線粒體DNA拷貝數(shù)、TOM20表達和MitoTracker Green熒光降低。P300/CBP敲低還抑制FSH誘導的線粒體膜電位升高。這些數(shù)據(jù)共同證明P300/CBP介導的H4K5la促進FSH驅(qū)動的顆粒細胞線粒體生物發(fā)生。
2.4 鑒定H4K5la調(diào)控的下游靶基因
為評估組蛋白乳酸化對FSH激活顆粒細胞中基因表達的影響，研究人員使用H4K5la特異性抗體進行CUT&Tag分析。質(zhì)量控制分析證實樣本間高相關性和適當?shù)腄NA片段大小分布。H4K5la峰主要富集于啟動子區(qū)域。GO分析顯示H4K5la靶基因在mGCs中強烈富集于代謝調(diào)控，而KEGG通路注釋同樣顯示在代謝網(wǎng)絡中富集，表明組蛋白乳酸化有助于線粒體生物發(fā)生的基礎代謝基因表達調(diào)控。為檢查功能后果，研究人員對LDHA/LDHB敲低后的FSH處理mGCs進行RNA測序。差異表達分析顯示與FSH處理對照相比，F(xiàn)SH + LDHA/B-si組中有1,773個下調(diào)基因和1,335個上調(diào)基因。下調(diào)基因的KEGG富集指向核心代謝過程，表明乳酸依賴性乳酸化支持線粒體生物發(fā)生的基礎代謝基因表達。通過整合CUT&Tag數(shù)據(jù)（下調(diào)的H4K5la峰）與FSH處理GCs ± LDHA/B敲低的RNA-seq數(shù)據(jù)（下調(diào)基因），研究人員鑒定出71個H4K5la靶基因，其轉(zhuǎn)錄在LDHA/B耗竭后顯著降低。為進一步將FSH誘導的H4K5la與線粒體生物發(fā)生聯(lián)系起來，研究人員分析了FSH處理mGCs的RNA-seq譜，鑒定出2,003個下調(diào)和1,718個上調(diào)基因。KEGG分析顯示上調(diào)轉(zhuǎn)錄本與線粒體生物發(fā)生通路密切相關。將這些基因與71個差異表達基因交叉參考，鑒定出22個被FSH顯著誘導且在LDHA/LDHB敲低后顯著下調(diào)的H4K5la靶基因。在這些基因中，HDAC4（一種作為乙?；侨樗峄脸鞯腍DAC II類去乙酰化酶）在其啟動子處顯示強烈的H4K5la富集。與此發(fā)現(xiàn)一致，qRT-PCR證實FSH刺激的mGCs和KGN細胞中草氨酸鹽處理或LDHA/LDHB敲低后HDAC4 mRNA表達降低。ChIP-qPCR進一步驗證了FSH刺激下HDAC4啟動子處的H4K5la富集，該富集被草氨酸鹽、LDHA/B沉默或使用C646抑制乳酸化寫入蛋白P300所減弱。免疫印跡顯示草氨酸鹽、LDHA/LDHB敲低或C646處理后HDAC4蛋白降低。免疫熒光染色證實抑制乳酸產(chǎn)生和H4K5la降低HDAC4蛋白表達，HDAC4主要定位于細胞核。這些結(jié)果共同確立FSH誘導的H4K5la驅(qū)動顆粒細胞中HDAC4的轉(zhuǎn)錄上調(diào)。
2.5 HDAC4促進FSH誘導的線粒體生物發(fā)生
在確立H4K5la調(diào)控HDAC4表達后，研究人員接下來研究了HDAC4在FSH處理顆粒細胞中的功能作用。使用LMK-235（特異性IIa類去乙?；讣易遛卓箘?，據(jù)報道可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平抑制HDAC4表達）處理顆粒細胞。如預期，LMK-235處理后KGN細胞中HDAC4表達以濃度依賴性方式降低。基于這些結(jié)果，選擇15 μM LMK-235作為后續(xù)實驗的標準濃度。通過qRT-PCR定量線粒體DNA含量、線粒體標志物TOM20免疫印跡和MitoTracker Green染色線粒體證明，HDAC4的藥理學抑制顯著減弱FSH誘導的mGCs和KGN細胞線粒體生物發(fā)生。為最小化LMK-235與HDAC4抑制無關的潛在脫靶效應，研究人員隨后采用siRNA介導的方法特異性沉默HDAC4。初步評估了四種靶向HDAC4的siRNA的基因沉默效率和特異性。FSH刺激下HDAC4敲低顯著損害線粒體生物發(fā)生，表現(xiàn)為線粒體DNA拷貝數(shù)減少、TOM20蛋白水平降低和MitoTracker Green熒光減弱。與此一致，HDAC4耗竭抑制KGN細胞中FSH誘導的OCR和ΔΨm增加。這些結(jié)果牢固確立HDAC4作為顆粒細胞響應FSH的線粒體生物發(fā)生關鍵調(diào)節(jié)因子。
2.6 HDAC4通過位點特異性去乙?；{(diào)節(jié)PGC-1α活性以促進線粒體生物發(fā)生
PGC-1α是代謝途徑的既定主調(diào)節(jié)因子。先前研究表明HDAC4直接靶向PGC-1α并在賴氨酸殘基K329和K330去乙?；哉{(diào)節(jié)其活性，但這些位點的乙?；欠裼绊懢€粒體生物發(fā)生仍未知。為解決這個問題，研究人員檢查了HDAC4介導的PGC-1α賴氨酸去乙?；诰€粒體調(diào)節(jié)中的作用。跨物種序列比對顯示PGC-1α K329/K330的強烈進化保守性，突出其潛在功能重要性。研究人員首先評估了FSH刺激的KGN細胞中PGC-1α乙?；?，觀察到FSH處理后乙酰化顯著降低，P300/CBP抑制劑C646逆轉(zhuǎn)了這一效應。類似地，HDAC4敲低增加了FSH處理細胞中PGC-1α乙?；?。接下來研究人員將K329/330殘基單獨突變?yōu)椴豢梢阴；木玜n酸（R）殘基或可乙?；墓萢n酰胺（Q）殘基，并檢查每個突變體暴露于FSH時的乙?；?。KGN細胞通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染表達野生型（WT）Flag-PGC-1α或其乙?；M（K329/330Q）和不可乙酰化（K329/330R）變體。為確保檢測直接乙酰化，免疫沉淀復合物用SDS解離后用泛乙酰賴氨酸抗體免疫印跡。K329/330R突變幾乎消除了FSH誘導的PGC-1α乙酰化，證實這些位點代表主要乙酰化位點。為全面繪制與PGC-1α相關的乙酰轉(zhuǎn)移酶，研究人員在NIH/3T3細胞中進行IP后質(zhì)譜分析。這種方法定義了PGC-1α相互作用組并鑒定出1,472個推定相互作用蛋白，包括其乙?；臐撛诮橘|(zhì)。GO富集分析突出顯示這些相互作用因子與線粒體生物發(fā)生通路的強烈關聯(lián)。基于功能注釋優(yōu)先篩選出11個候選乙酰轉(zhuǎn)移酶。靶向siRNA篩選鑒定DLAT和ACAT1為PGC-1α翻譯后修飾的關鍵調(diào)節(jié)因子，其耗竭顯著降低PGC-1α乙酰化。后續(xù)co-IP實驗證實兩種酶與PGC-1α相互作用，這些相互作用被FSH刺激動態(tài)破壞。研究人員隨后評估PGC-1α乙酰化是否影響FSH誘導的線粒體生物發(fā)生。KGN細胞在siRNA介導的內(nèi)源性PGC-1α耗竭后轉(zhuǎn)染W(wǎng)T PGC-1α或K329/330R和K329/330Q突變體。K329/330R突變體（去乙?；M）顯著增強線粒體生物發(fā)生，而乙?；MK329/330Q突變體損害線粒體生物發(fā)生，表現(xiàn)為（a）線粒體DNA拷貝數(shù)減少，（b）TOM20水平降低，和（c）MitoTracker Green染色減少。相應地，K329/330R突變體升高線粒體OCR、ATP水平和ΔΨm，而K329/330Q突變體產(chǎn)生相反效應。這些發(fā)現(xiàn)共同證明FSH通過HDAC4介導的PGC-1α K329/330去乙酰化促進線粒體生物發(fā)生。
2.7 PGC-1α去乙?；心糔RF1/2以驅(qū)動線粒體生物發(fā)生
PGC-1α作為線粒體生物發(fā)生的主調(diào)節(jié)因子，協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子如NRF1和GABPA（NRF2）激活線粒體功能所需的核基因。為確定K329/330乙酰化如何影響PGC-1α活性，研究人員通過co-IP檢查FSH依賴性變化。FSH刺激顯著增強PGC-1α與NRF1/NRF2的相互作用，而破壞乳酸依賴性H4K5la消除這一效應。類似地，暴露于P300/CBP抑制劑C646或HDAC4耗竭顯著減弱KGN細胞中FSH誘導的PGC-1α-NRF1/2復合物形成。為評估K329/330乙?；墓δ芤饬x，研究人員在KGN細胞中表達Flag標記的PGC-1α變體（WT、乙酰化缺陷K329/330R或乙?；MK329/330Q）。K329/330R突變增強FSH刺激下PGC-1α與NRF1/NRF2的結(jié)合，而K329/330Q變體顯著損害這些相互作用。與此一致，ChIP-qPCR顯示FSH處理細胞中K329/330R突變體對NRF1/NRF2靶基因（TFAM、TFB1M、TFB2M）啟動子的占據(jù)增加，而K329/330Q突變體染色質(zhì)結(jié)合顯著降低。這些結(jié)果共同表明PGC-1α在K329/330的去乙?；龠M其招募至NRF1/2并驅(qū)動響應FSH的線粒體基因程序激活。PGC-1α必須從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細胞核以發(fā)揮轉(zhuǎn)錄輔激活因子功能。為確定乙酰化是否調(diào)節(jié)其亞細胞分布，研究人員用Flag標記的WT PGC-1α轉(zhuǎn)染KGN細胞并進行核-胞質(zhì)分級分離。FSH處理誘導PGC-1α強烈的核定位，而LMK-235抑制HDAC4或HDAC4特異性siRNA減弱這一核積累。為進一步探究K329/330乙?；淖饔茫芯咳藛T表達WT、K329/330R或K329/330Q PGC-1α構建體后進行亞細胞分級分離。K329/330R突變體增強FSH刺激的PGC-1α核進入，而K329/330Q突變體減弱核定位。免疫熒光染色證實這些結(jié)果，顯示FSH處理細胞中K329/330R變體的胞質(zhì)-核轉(zhuǎn)位增加和K329/330Q突變體的核-胞質(zhì)重新分布增強。這些發(fā)現(xiàn)表明FSH降低PGC-1α乙?；?，促進其核進入并增強線粒體生物發(fā)生。
2.8 抑制H4K5la/HDAC4/PGC-1α通路損害體內(nèi)FSH誘導的線粒體生物發(fā)生和卵泡發(fā)育
為評估H4K5la/HDAC4/PGC-1α通路的生理相關性，接受FSH的小鼠用靶向該軸關鍵組分的抑制劑處理：C646（P300/CBP乳酸化抑制劑）、LMK-235（HDAC4拮抗劑）或SR-18292（PGC-1α乙?；せ顒646處理消除了卵巢顆粒細胞中FSH誘導的H4K5la，并伴隨抑制HDAC4表達。與HDAC4介導的PGC-1α去乙酰化一致，通路阻斷增加PGC-1α乙?；⑵茐腜GC-1α-NRF1/NRF2相互作用。重要的是，該通路阻斷顯著損害FSH誘導的線粒體生物發(fā)生，表現(xiàn)為線粒體基因表達降低、mtDNA拷貝數(shù)減少和TOM20蛋白水平降低。線粒體缺陷伴隨雌二醇（E2）產(chǎn)生減少和顆粒細胞增殖降低。在器官水平，抑制劑處理的小鼠表現(xiàn)出卵巢變小、卵巢重量降低、卵泡發(fā)育停滯和竇卵泡形成減少。這些發(fā)現(xiàn)共同證明H4K5la/HDAC4/PGC-1α軸對FSH介導的卵泡發(fā)育至關重要，通過支持線粒體代謝適應。
n 研究結(jié)論
本研究揭示了一個先前未表征的FSH依賴性代謝-表觀遺傳通路，將糖酵解與線粒體生物發(fā)生聯(lián)系起來。FSH刺激的糖酵解增加細胞內(nèi)乳酸，通過P300/CBP介導的H4K5組蛋白乳酸化（H4K5la），該修飾富集于代謝基因啟動子并直接激活HDAC4轉(zhuǎn)錄。HDAC4介導的PGC-1α在K329/K330去乙?；龠MNRF1/2招募和線粒體DNA復制及線粒體生物發(fā)生必需基因的轉(zhuǎn)錄。該機制可能代表代謝通量控制細胞器生物發(fā)生表觀遺傳調(diào)控的更廣泛原理，為理解FSH依賴性生殖生理提供了機制見解，并突出了生殖障礙代謝功能障礙的潛在治liao機會。
Wu G, Chen M, Li C, Wei M, Pan Y, He T, Liu Z, Li H, Zhang C, Zhang JQ, Sheng Y, Liu Y, Liu H, Shen M. Histone Lactylation Couples FSH-Driven Lactate Metabolism to Mitochondrial Biogenesis by Enhancing HDAC4-Mediated Deacetylation of PGC-1α in Granulosa Cells. Research (Wash D C). 2026 Jan 15;9:1045. doi: 10.34133/research.1045. PMID: 41551912; PMCID: PMC12804605.
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